Sản Phẩm

Thống kê

NGUYÊN TẮC VÀ KỸ THUẬT TRỮ LẠNH TẾ BÀO

1.Nguyên tắc của trữ lạnh Để trữ tế bào sống trong một thời gian dài thì tất cả hoạt động chức năng bên trong tế bào phải ngừng lại. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196oC) hầu hết mọi phản ứng hóa học đều không xảy ra được. Các phân tử nước tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian như ngừng trôi đối với tế bào được trữ. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng đến tế bào trữ là bức xạ từ môi trường. Tuy nhiên trong thực tế yếu tố này không quan trọng và một nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi được chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi rã đông, và chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào. Giai đoạn chính ảnh hưởng đến thành công của trữ lạnh chính là giai đoạn làm lạnh và rã đông.

1.1. Những thay đổi bên trong tế bào khi làm lạnh
Để đạt được nhiệt độ trữ, tế bào sống phải được làm lạnh từ nhiệt độ sống (thân nhiệt đối với tế bào động vật) xuống đến -196oC. Quá trình này gây ra một số thay đổi trong môi trường và cả trong tế bào có khả năng ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tế bào được trữ:
-    Giảm tốc độ hoạt động của enzyme:
Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37oC xuống còn 7oC, hoạt động của enzyme giảm 8 lần. Tuy nhiên ảnh hưởng của giảm hoạt động enzyme lên tế bào vẫn chưa được làm sáng tỏ.
-    Giảm độ hòa tan của các khí trong môi trường.
Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng CO2 làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường. Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng hòa tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng làm tổn hại đến tế bào.
-    Hình thành tinh thể nước đá.
Nước trong môi trường khi lạnh khoảng 10-15oC sẽ dần kết tinh thành những tinh thể nước tinh khiết. Hiện tượng này xảy ra do môi trường có pha chất hòa tan cũng như chất bảo quản lạnh có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường. Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan.
-    Tăng nồng độ chất hòa tan trong môi trường.
Đây là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Khi nước chuyển sang dạng tinh thể tinh khiết, lượng nước ở thể lỏng giảm đi. Do đó, nồng độ các chất hòa tan tăng lên gây mất cân bằng về áp lực thẩm thấu, kéo nước từ bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương màng lipoprotein của tế bào.
- Tăng nhiệt độ tiềm ẩn.
Đây cũng là một hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Phân tử nước khi chuyển từ thể lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra một nhiệt lượng. Nếu nhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0oC. Thay đổi này ảnh hưởng đến chức năng của tế bào sau khi rã đông.
2. Biện pháp hạn chế tác động khi làm lạnh
Để giải quyết những tác động gây nên trong quá trình làm lạnh nêu trên, ba biện pháp kỹ thuật chính được sử dụng:
2.1. Kiểm soát tốc độ làm lạnh.
Tốc độ làm lạnh càng nhanh thì tinh thể tạo ra bên trong tế bào càng nhiều. Tùy theo thể tích và diện tích màng bào tương mà mỗi loại tế bào có tốc độ làm lạnh để trữ tối ưu khác nhau. Với tế bào trứng và phôi người, tốc độ tối ưu theo nghiên cứu là 0,3oC/phút. Tốc độ này cho phép sự trao đổi nước qua màng có thể diễn ra trước khi hoàn toàn chuyển thành thể rắn.
2.2. Sử dụng chất bảo quản lạnh.
Nếu làm lạnh càng chậm thì giảm được sự hình thành tinh thể bên trong tế bào, giảm tổn thương bào quan. Tuy nhiên thời gian tế bào tiếp xúc với môi trường có nồng độ chất hòa tan cao càng lâu thì tế bào càng bị tổn thương màng bào tương. Để giải quyết mâu thuẫn này, chất bảo quản lạnh được đưa vào sử dụng. Đây là những chất tan trong nước, có khả năng tạo liên kết hydro với phân tử nước và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào. Với những tính chất này, chất bảo quản xâm nhập và thay chỗ cho nước bên trong tế bào, giúp làm giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào và giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước đá.
Do không tạo thành tinh thể, chất bảo quản lạnh hạn chế sự gia tăng nồng độ của chất hòa tan. Nó còn kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế bào. Tuy nhiên, những ghi nhận về hiệu quả của từng loại chất bảo quản khác nhau lên từng loại tế bào khác nhau (ví dụ như phôi ở những giai đoạn khác nhau) chỉ dựa trên quan sát thực tế, cơ chế chưa được chứng minh. Bốn loại chất bảo quản lạnh hiện đang được sử dụng trong trữ phôi là Glycerol, Dimethyl sulfoxide, 1,2- propanediol (hay propylen glycol) và 1,2-ethanediol (hay ethylene glycol). Đây là những chất bảo quản lạnh nội bào vì có khả năng xâm nhập tế bào.
Một số đại phân tử tuy không xâm nhập tế bào nhưng cũng được xem như những chất bảo quản lạnh, được dùng kèm với những chất bảo quản lạnh nội bào. Các chất này (thường là mono-, di- hoặc tri-saccharide) có tác dụng làm giảm áp lực thẩm thấu bên ngoài tế bào, đồng thời giúp giảm lượng nước bên trong tế bào để giảm tổn thương do hình thành tinh thể nước đá.
2.3. Khởi phát sự tạo thành tinh thể nước đá.
Biện pháp này nhằm hạn chế sự tăng nhiệt độ tiềm ẩn do các tinh thể nước được tạo điều kiện để hình thành dần dần. Ở khoảng -7oC, môi trường được cho tiếp xúc một vật có nhiệt độ rất lạnh. Tinh thể nước đá hình thành từ điểm tiếp xúc sẽ kích thích hình thành các tinh thể khác dần dần lan tỏa khắp môi trường. Kỹ thuật này được gọi là tạo mầm tinh thể, giúp hạn chế hiện tượng tăng nhiệt độ tiềm ẩn qua đó tránh được tác động của tăng nhiệt độ tiềm ẩn.
3. Ảnh hưởng của bảo quản và rã đông
Như đã trình bày trong phần trước, tế bào có thể được bảo quản ở tình trạng đông lạnh trong nhiều năm. Quá trình rã đông đưa tế bào từ nhiệt độ bảo quản là - 196oC trở lại nhiệt độ sống ban đầu của tế bào. Qui trình rã đông có liên hệ chặt chẽ với qui trình làm lạnh, hay cụ thể hơn là phụ thuộc vào lượng tinh thể nước đá còn lại bên trong tế bào. Hiện tượng tái kết tinh hóa xảy ra trên những tinh thể này khi rã đông có khả năng tạo nên những tinh thể lớn làm tổn thương tế bào. Do vậy tốc độ rã đông phải đủ nhanh để hạn chế hiện tượng tái kết tinh hóa xãy ra.
Mặc khác, tốc độ rã đông lại không được quá nhanh để nước có thể kịp trở lại vào bên trong tế bào. Với việc sử dụng chất bảo quản lạnh, phác đồ làm lạnh và rã đông đối với phôi đã được đơn giản hóa, thời gian thực hiện cũng được rút ngắn. Ứng với tốc độ làm lạnh 0,3oC/phút thì tốc độ rã đông có thể đạt tới 300oC/phút. Cuối cùng phôi được rửa sạch các chất bảo quản lạnh để tiếp tục nuôi cấy trong môi trường.

Trích nguồn: Tạp chí Y Học - Khoa Hiếm muộn - Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ